2017年8月，FDA批準上市了全球第一款CAR-T藥物——Kymriah，適應癥為急性淋巴性白血病，由此開啟了人類CAR-T療法的新紀元。

CAR-T療法，全稱Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，即嵌合抗原受體T細胞免疫療法。簡單來說，CAR-T技術就如同給T細胞裝上了GPS導航系統，通過識別并殺傷癌細胞實現治療的目的。

接續上期的《FDA指南解讀！CAR-T 細胞產品開發在CMC階段的五大注意事項》，本期將繼續圍繞近期FDA正式發布的 “Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products”，帶來CAR-T 細胞產品開發在非臨床階段的專業解讀。

（1）使用具有相同抗原識別域的單克隆抗體或融合蛋白進行組織交叉反應性研究，即分析預期靶向性的功能問題；

（2）對各種器官/組織的人類原代細胞、細胞系、誘導多能干細胞衍生測試系統等進行細胞毒性測試，即分析非預期靶向性的細胞毒性測試；

（3）蛋白質陣列，即通過分析微陣列、功能微陣列和反相微陣列，分析混合物中蛋白質的結合親和力、特異性和蛋白質表達水平；

（4）相關動物模型，即分析非預期靶向性的毒性，或體內脫靶效應。

（5）對目標抗原測定表征，即分析蛋白質的各項特性，包括結構、理化、活性等一系列內容。

FDA建議申報時包含以前有相同抗原識別域的CAR或單克隆抗體（如適用）的臨床經驗中的信息，這可能會減少或消除進行額外特異性和親和力測試。確定潛在的脫靶活動對于制定入組標準和特定的輸液后評估和監測計劃非常重要。

此外，由于產品之間的固有差異（例如，CAR-T細胞運輸、擴增、產生細胞因子、誘導細胞毒性和持久性的能力），利用相同單鏈可變片段（scFv）的CAR-T細胞和單克隆抗體的安全性可能不同。

多種整合到CAR-T細胞中的激活和共刺激結構域，包括CD3ζ鏈、4-1BB（CD137）、CD28和CD40等，這些域組合可導致不同的生物學特性。這可能會影響體內細胞擴增、持久性和其他免疫細胞類型激活的程度。解決CAR-T細胞非依賴細胞因子生長和不受控制增殖的可能性是臨床前評估的另一個重要方面。

（2）含有其他污染細胞（如NK細胞、B細胞等）的未選擇T細胞池；

（3）病毒抗原特異性T細胞（例如巨細胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV））；

（4）選擇干細胞樣或“年輕”T細胞。

因此，臨床前評估可能包括檢測細胞因子非依賴性細胞生長、體外和體內T細胞克隆性測試、核型分析、TCR譜分析，以及通過體外刺激和識別檢測對病毒抗原的特異性。

圖1：患者來源的異種移植小鼠用于CAR T細胞評估，文獻：Humanized Mice Are Precious Tools for Preclinical Evaluation of CAR T and CAR NK Cell Therapies[J]. Cancers, 2020, 12(7)

CAR-T細胞安全和活性的參數是多因素的，包括：

（1）載體結構的設計（例如，抗原識別結構域、信號結構域、跨膜結構域和鉸鏈結構域），引入的外源基因種類、數量、長度越少越好；

（2）載體傳遞方法，病毒類載體元件涉及的越少越好；

（3）細胞來源，背景越明確越好；

（4）操作過程（例如激活、細胞選擇），人員操作越少越好；

（5）生物活性（例如，細胞因子表達譜、細胞毒性、增殖），數據越全越好；

（6）添加新成分（如自殺基因、免疫調節元件），背景和數據越全越好。

NMPA于2021年11月頒布的《基因修飾細胞治療產品非臨床研究技術指導原則（試行）》對基因修飾細胞治療產品非臨床有效性和概念驗證、藥代動力學、轉基因表達產物和插入突變風險評估做了論述，強調了免疫細胞應盡可能采用多種方法評估其靶點相關毒性和脫靶毒性風險。