免疫檢查點分子是調節免疫應答激活與抑制平衡的關鍵分子。在正常生理狀態下，抑制性免疫檢查點在自身耐受和自身免疫防御中發揮重要作用，但在腫瘤患者中，抑制性免疫檢查點表達上調，導致免疫逃逸。例如，抑制性免疫檢查點CD274（也稱為PD-L1）與T細胞上的程序性細胞死亡（PD）-1受體相互作用以抑制T細胞活化，在許多癌癥中過表達。目前，通過阻斷這些相互作用來進行癌癥治療效果顯著，但具體調控機制尚不明確。

近日，來自紐約大學基因組和系統生物學中心的Rahul Satija課題組的研究人員在《Nature Genetics》上發表了題為Characterizing the molecular regulation of inhibitory immune checkpoints with multimodal single-cell screens的研究成果，其開發了一種新型單細胞測序技術，識別和驗證PD-L1的轉錄和轉錄后調控模式，從而確定了一種調節免疫檢查點的新機制。

DOI: 10.1038/s41588-021-00778-2

通常癌細胞通過上調免疫檢查點分子（如PD-L1）逃避免疫監視，阻斷該過程可顯著增強抗腫瘤免疫反應，特別是在免疫治療期間。因此，亟需對抑制性免疫檢查點表達調控進行深入研究。

為了開發一個可以同時研究多個免疫檢查點的實驗系統，研究人員篩選了四種癌細胞系（THP-1，K562，KG-1和U93），測試它們在應答中上調免疫檢查點的能力。結果發現，使用IFN-γ、地西他濱（DAC）和轉化生長因子（TGF）-β1刺激THP-1細胞，可以顯著誘導三個免疫檢查點表達：PD-L1，PD-L2和CD86。隨后，研究人員將CRISPR兼容性CITE-seq技術相結合，新開發了ECCITE-seq技術，同時測量細胞轉錄組以及PD-L1、PD-L2和CD86的表面蛋白水平，并檢測gRNA。

CITE-seq和ECCITE-seq識別PD-L1表達調控

為了鑒定免疫檢查點的調節劑，研究人員將刺激和未刺激的THP-1細胞進行CITE-seq，發現200個與PD-L1表達相關的基因，8個具有調節作用的基因，以及其他18個基因，包括轉錄因子、染色質調節劑、信號調節劑和蛋白質穩定調節劑。此外，ECCITE-seq技術可對免疫檢查點調節劑進行驗證。

ECCITE-seq數據集UMAP可視化

并且，研究顯示出兩組分界清晰的細胞群，一群細胞表達干擾IFN-γ上游分子（IFNGR1，IFNGR2，JAK2，STAT1），另一群細胞缺乏IRF1編碼的IFN-γ下游分子。隨后，研究人員發現CUL3和BRD4是PD-L1表達的負調控因子，干擾CUL3-KEAP1復合物可抑制NRF2泛素化，從而促進PD-L1轉錄表達，也就是說CUL3–KEAP1復合物是PD-L1的間接調節劑。

CUL3-KEAP1復合物通過NRF2間接調節PD-L1

簡而言之，研究人員通過將CRISPR篩選與單細胞mRNA和表面蛋白檢測相結合，開發了CRISPR兼容CITE-seq技術，發現PD-L1的多種調節劑，并且揭示一種調節免疫檢查點的新機制。更重要的是，該研究推出了一種強大的分析技術，將極大的推動未來多模式單細胞研究。

參考資料：

[1]https://www.nature.com/articles/s41588-021-00778-2